1. Celulele de crioconservat trebuie să fie într-o stare de creștere bună (faza log) și o rată de supraviețuire ridicată, cu o densitate de aproximativ 80-90%.
2. Verificați dacă celulele își păstrează în continuare proprietățile unice înainte de înghețare.
De exemplu, hibridomul trebuie testat pentru producerea de anticorpi cu una până la două zile înainte de crioconservare.
3. Acordați atenție calității crioprotectorului.
DMSO trebuie să fie de calitate reactiv, steril și incolor (filtrat cu 0,22 microni FGLP Telflon sau produse sterile achiziționate direct, cum ar fi Sigma D-2650), alicotat în volume mici de 5-10 ml, depozitat la 4 oC în întuneric. Nu dezghețați de mai multe ori. Glicerolul trebuie, de asemenea, să fie de calitate reactiv și depozitat la întuneric după autoclavare. Utilizați în termen de un an de la deschidere, deoarece va fi toxic pentru celule după depozitare pe termen lung.
4. Concentrația celulară pentru crioconservare:
(1) Fibroblast uman normal: 1~3 x 106 celule/ml
(2) Hibridom: 1 ~ 3 x 106 celule/ml, concentrația celulară nu trebuie să fie prea mare, unele hibridoame vor muri după dezghețare 24 de ore din cauza concentrației ridicate de îngheț.
(3) Liniile tumorale aderente: 5~7 x 106, în funcție de tipul de celulă. Adenocarcinomul necesită o concentrație mai mare după decongelare, în timp ce HeLa are nevoie doar de 1-3 x 106 celule/ml.
(4) alte suspensii: 5~10 x 106 celule/ml, limfocitul uman trebuie să fie de cel puțin 5 x 106 celule/ml.
5. Concentrația de crioprotector este de 5 sau 10% DMSO. Dacă condițiile de congelare ale celulelor sunt incerte, trebuie utilizată o cultură de rezervă în timpul crioconservarii pentru a preveni eșecul înghețului.
6. Metoda de congelare:
(1) Metoda tradițională: 4 oC 10 minute ---> -20 oC 30 minute ---> -80 oC 16-18 ore (sau peste noapte) ---> Depozitare pe termen lung în faza de vapori a rezervorului de azot lichid .
(2) Program de răcire: Utilizați o mașină de răcire cu viteză constantă pentru a reduce de la temperatura camerei la –120 oC la o rată de –1 ~ -3 oC/min și depozitați-o în faza de vapori a unui rezervor de azot lichid pentru o perioadă lungă de timp. depozitare pe termen. Este potrivit pentru conservarea celulelor în suspensie și hibridom.
7. Material:
(1) Celule cultivate care cresc bine
(2) Mediu proaspăt
(3) DMSO (Sigma D-2650)
(4) Tub de crioconservare din plastic steril (Nalgene 5000-0020)
(5) 0,4% g/v albastru tripan (GibcoBRL 15250-061)
(6) Placă de hemocitometru și sticlă de acoperire
(7) Mașină de răcire cu viteză constantă (KRYO 10 seria II)
8. Pași:
(1) Schimbați jumătate sau întreaga cantitate de mediu cu o zi înainte de congelare și observați creșterea celulelor.
(2) Prepararea soluției de crioconservare (prepararea înainte de utilizare): Se adaugă DMSO în mediu proaspăt, concentrația finală este de 5-10%, se amestecă bine și se pune la temperatura camerei pentru utilizare ulterioară.
(3) Conform operațiunii de subcultură celulară, colectați celulele cultivate și luați o cantitate mică de suspensie celulară (aproximativ 0,1 ml) pentru a număra concentrația celulară și rata de supraviețuire înainte de congelare.
(4) Se centrifugă, se îndepărtează supernatantul, se adaugă o cantitate adecvată de soluție de crioconservare pentru a obține concentrația celulară de 1-5 x 106 celule/ml, se amestecă bine și se distribuie în tubul de crioconservare etichetat, 1 ml/fiolă și se ia un mic cantitatea de suspensie celulară pentru detectarea contaminării.
(5) Metoda de crioconservare 1: Criotubul este plasat la 4 oC timp de 10 minute → -20 oC timp de 30 de minute → -80 oC timp de 16 până la 18 ore (sau peste noapte) → faza de vapori a rezervorului de azot lichid pentru depozitare pe termen lung.
(6) Metoda de depozitare prin congelare 2: tubul de congelare este plasat într-o mașină de răcire cu viteză constantă cu un program stabilit și apoi plasat într-un rezervor de azot lichid.
英语
阿拉伯语
���ļ���